Nature | 为何靶向药常在老年患者中折戟？衰老压力下的代谢重编程与谷氨酰胺回补机制给出答案

年龄是众多人类疾病中最大的独立风险因素，在肿瘤学领域更是如此。传统认知往往将衰老仅仅视为一种“时间积累”，即机体随着岁月流逝，积累了更多的基因突变，从而增加了癌症发病的概率。然而，衰老仅仅是一个被动的计时器吗？生理性的衰老过程是否会作为一种主动的力量，直接参与并重塑肿瘤的进化轨迹？

3月11日，《Nature》的研究报道“Ageing promotes metastasis via activation of the integrated stress response”，研究人员深入剖析了衰老对由 KRAS 驱动的肺腺癌 (Lung adenocarcinoma) 进展的深远影响。这项研究不仅挑战了我们对肿瘤生长的传统认知，更揭示了一个反直觉的现象：衰老在限制原发肿瘤生长的同时，通过表观遗传途径激活了整合应激反应(Integrated stress response, ISR)，赋予了肿瘤细胞致命的转移能力。

在探讨肿瘤机制的体内研究中，一个长期被忽视的盲区是实验动物的年龄。现有的肺癌基因工程小鼠模型 (Genetically engineered mouse models, GEMMs) 实验，几乎全部是在年轻小鼠（通常为 2 至 3 个月大）中进行的。然而，临床现实中，非小细胞肺癌 (Non-small cell lung cancer, NSCLC) 患者的

诊断中位年龄高达 70 岁，发病高峰集中在 65 至 75 岁之间

。这种实验模型与真实世界患者群体在年龄维度上的严重脱节，可能是许多在临床前研究中表现优异的靶向疗法，在人体临床试验中折戟沉沙的重要原因之一。

为了弥合这一差距，研究人员巧妙地运用了经典的 KP 小鼠模型（携带 Kras-G12D 突变且 Trp53 基因敲除）。他们在 2 至 3 个月大的年轻 KP 小鼠 (KP-Young) 以及 18 至 19 个月大的老年 KP 小鼠 (KP-Old) 的肺部，通过气管内滴注含有 Cre 重组酶的病毒颗粒，同步诱发了肺部肿瘤。在这个体系中，18 至 19 个月大的老龄小鼠在经历 5 至 6 个月的肿瘤发展期后，其生理年龄恰好对应人类的 70 岁左右，完美复刻了人类非小细胞肺癌最典型的高发受众群体特征。

宏观层面的数据展现出了一个令人意外的悖论：与年轻小鼠相比，

老年 KP 小鼠肺部的原发肿瘤负荷 (Tumour burden) 出现了高达 2.5 倍的显著下降

。不仅如此，组织学和免疫组化 (Immunohistochemistry, IHC) 分析进一步证实，老年小鼠体内的

肿瘤数量更少、体积更小

，且增殖标志物（如磷酸化组蛋白 H3）的表达水平更低。如果仅凭这些数据，人们可能会误以为衰老对肿瘤发展具有某种“保护性”抑制作用。

然而，疾病的恶性程度并非单纯由肿瘤体积决定。组织学分型数据表明，尽管原发肿瘤负荷较低，但

老年 KP 小鼠体内腺癌 (Adenocarcinoma) 所占的比例却显著高于年轻小鼠

。更令人警醒的是纵向跟踪的数据：在年轻小鼠中，原发肺部肿瘤负荷随着时间（140 天至 357 天）呈线性持续增长；但在老年小鼠中（106 天至 247 天），尽管原发肿瘤始终保持在较低负荷，

小鼠却极早地出现了局部淋巴结和远端器官的转移，并伴随着整体生存期的急剧缩短

。

这一系列详实的数据提出了一个核心生物学问题：为什么老年宿主环境中，那些体积更小、生长更缓慢的原发肿瘤，却能以更快的速度跨越恶性进展的鸿沟，演变成致命的转移性肺腺癌？

为了解答上述悖论，研究人员从年轻和老年 KP 小鼠中分别建立了原代肿瘤细胞系（分别命名为 KP-Y 和 KP-O）。在常规的二维体外培养条件下，这两组细胞表现出相似的增殖速率，并且均表达肺泡 II 型 (Alveolar type 2, AT2) 细胞的谱系标志物 pro-SPC，证实了它们具有相同的细胞起源。

然而，当环境的生存压力增加时，两者的差异开始显现。转移的先决条件之一是肿瘤细胞必须具备失巢凋亡抵抗 (Anoikis resistance) 的能力。正常上皮细胞在脱离细胞外基质后会启动自杀程序，而 KP-O 细胞在悬浮培养条件下，

展现出了显著升高的细胞活力和大幅降低的 Caspase 3/7 凋亡酶活性

，其失巢凋亡抵抗能力远超 KP-Y 细胞。在更复杂的模拟细胞外基质的三维（3D）培养体系中，KP-O 细胞在 Matrigel 基质胶中形成了直径更大的微球体 (Spheroids)，并在胶原蛋白 (Collagen) 基质中展现出更具侵袭性的生长结构，具有更多的“前导细胞” (Leader cells)。

体外数据的差异仅仅是冰山一角，体内转移实验的证据链则更加完整。研究人员采用了三种不同的注射模型，全面评估了这些细胞的转移潜能。首先是尾静脉注射模型，数据表明，KP-O 细胞在小鼠体内不仅形成了更高的肺部转移负荷，还展现出更广的器官趋向性，

在肾脏和心脏的转移发生率显著增加

。

但尾静脉注射无法完全模拟肿瘤细胞从原发灶突破血管的完整生物学过程。因此，研究人员进一步采用了皮下移植和原位移植模型。在皮下移植实验中，组织学分析显示 KP-O 细胞能够形成更多的远端肺部转移灶，并显著增加了肺部转移负荷。而最为关键的原位移植模型（将肿瘤细胞直接注射入小鼠肺部实质）给出了最震撼的对比结果：KP-O 细胞展现出了极高的肿瘤植入效率，并且展现出强大的多器官定植能力。

高达 80%

接受 KP-O 细胞原位移植的小鼠出现了肝脏、肾脏和大脑等远端器官的转移，而接受 KP-Y 细胞移植的小鼠中，

这一比例为 0%

。随之而来的是，接受 KP-O 细胞移植的小鼠生存期大幅缩短。此外，与老年 KP 小鼠自发肿瘤一致，KP-O 细胞形成的转移灶出现了明显的谱系重塑，表现为肺源性转录因子 NKX2-1 表达的缺失和转移相关蛋白 HMGA2 表达的获得。

上述多维度的在体实验数据共同指向了一个清晰的结论：生理性的衰老过程在细胞内源性层面重塑了肺癌细胞，限制了它们在原位的高速增殖，却为其换取了挣脱原位微环境束缚、进行远端器官播散与定植的致命特权。

是什么导致了 KP-O 与 KP-Y 细胞在转移潜能上呈现出天壤之别？衰老相关的细胞状态改变通常伴随着染色质可及性 (Chromatin accessibility) 的表观遗传重构。研究人员对两组原代细胞进行了无偏倚的转录组测序 (RNA-seq) 和转座酶可及性染色质测序 (ATAC-seq)。

高通量数据的比对结果揭示了巨大的差异：在 KP-O 细胞中，共鉴定出

2022 个差异表达基因 (DEGs) 和高达 27206 个差异可及的染色质区域

。通过对这些海量数据进行通路富集分析（如 GSEA 和 GREAT），研究人员在转录和表观遗传双重层面，锁定到了两个高度重叠且占据主导地位的核心生物学通路：

上皮-间质转化 (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 和未折叠蛋白反应 (Unfolded Protein Response, UPR)

。

在这些通路中，未折叠蛋白反应（UPR）引起了特别的关注。UPR 是细胞内质网应激 (ER stress) 的经典应对机制，主要通过三个分支传递信号：IRE1α、ATF6 以及 PERK-eIF2α-ATF4。通过对 KP-O 细胞中富集的差异基因进行 STRING 蛋白互作网络分析，数据明确显示，一个以 ATF4 为核心的调控网络被显著富集，而 IRE1α 和 ATF6 分支则缺乏功能性关联。这强烈暗示，

在老年肿瘤细胞中，主要是 UPR 体系中的 PERK-ATF4 分支被特异性激活

。

内质网应激及其下游的整合应激反应（ISR）对于转移中的肿瘤细胞至关重要，因为它们在进入血液循环或到达营养贫乏的新环境中时，必然面临严峻的代谢和环境压力。为了探究衰老如何微调这一通路，研究人员将细胞置于低葡萄糖（1 mM）的营养应激环境中长达 6 至 24 小时。数据显示，在低糖条件下，KP-O 细胞表现出异常强烈的 PERK 分支激活，其 PERK 和 eIF2α 的磷酸化水平（p-PERK 和 p-eIF2α）以及下游 ATF4 的蛋白表达量均显著高于年轻细胞。

更为关键的是动力学数据的差异。在年轻细胞中，应激诱导的 p-eIF2α 升高是暂时的，随后通过反馈调节被迅速下调；而在 KP-O 细胞中，

p-eIF2α 的水平在应激期间持续居高不下

。即使是更换培养基这类极其轻微的环境扰动，也能在 KP-O 细胞中触发显著的 p-eIF2α 上调，这表明

衰老细胞激活整合应激反应的“阈值”被大幅降低了

。而在蛋白层面，受 GADD34 等反馈机制的影响，尽管后期 p-eIF2α 水平有所回落，但 KP-O 细胞内的 ATF4 蛋白表达却能够长时间维持在高位。

ATAC-seq 的表观遗传数据为这种异常的持续激活提供了深层的机制解释。在 KP-O 细胞中，

核心驱动基因 Atf4 的基因座 (Locus) 表现出更开放的染色质可及性

，这与转录活性的增强和应激状态下 ATF4 的快速诱导完全一致。与此同时，一系列负责“解除”未折叠蛋白反应和应激状态的抑制性基因座（如 Hspa5、Wfs1、Gadd34、Herpud1 和 Optn）的染色质可及性却显著降低。这种

“开启油门”同时“破坏刹车”

的表观遗传锁定机制，导致了老年肿瘤细胞无法有效清除应激信号，进而形成了一种持续存在、难以消除的 ATF4 高表达状态。实验进一步证实，当使用转录抑制剂（如放线菌素 D）时，年轻和老年细胞中的 ATF4 蛋白都会迅速耗竭；但如果仅使用蛋白酶体抑制剂阻止蛋白降解，KP-O 细胞中积累的 ATF4 远多于年轻细胞。这进一步确证了 KP-O 细胞中高水平的 ATF4 主要源于染色质开放带来的转录驱动，而非仅仅是蛋白质稳定性的改变。

作为整合应激反应的转录主控因子，ATF4 在先前的基础研究中已被证实与失巢凋亡抵抗和转移高度相关，并在人类癌细胞系数据中与肝转移的发生率呈强正相关。组织切片数据同样印证了这一点：与年轻小鼠相比，老年 KP 小鼠的肿瘤组织中 ATF4 核阳性细胞的比例大幅增加。

然而，相关性并不等于因果性。为了确证 ATF4 在衰老诱导的肿瘤转移中究竟扮演着“旁观者”还是“主导者”的角色，研究人员进行了一系列严密的干预实验。首先是药理学阻断，研究人员使用了

整合应激反应抑制剂 (ISRIB)

。ISRIB 能够解除 eIF2α 磷酸化对翻译的抑制，从而在下游阻断 ATF4 的表达。在不影响贴壁细胞存活率的剂量下，长期暴露于 ISRIB 显著降低了 KP-O 细胞中 ATF4 及其靶基因的蛋白水平。伴随分子层面改变的是表型的逆转：ISRIB 处理

大幅削弱了 KP-O 细胞的失巢凋亡抵抗能力、克隆形成能力

，并在静脉注射模型中显著降低了其体内肺部转移的负荷。针对上游 PERK 激酶的抑制剂同样减弱了失巢凋亡抵抗，从侧面佐证了 PERK-ATF4 轴的作用。

为了排除小分子药物的脱靶效应，研究人员进一步采用了基因编辑技术。通过 CRISPR-Cas9 介导的基因敲除以及多西环素诱导的 shRNA 介导的基因敲低，研究人员特异性地清除了 ATF4。蛋白质印迹 (Western blot) 数据证实，靶向 ATF4 后，其关键下游代谢靶点（如 ASNS 和 SLC7A11）的表达随之锐减。功能实验显示，敲除或敲低 Atf4 基因，显著降低了 KP-O 细胞的失巢凋亡抵抗能力，下调了 EMT 相关标志物的表达。更为决定性的是体内实验数据：在尾静脉注射模型中，

缺失或敲低 ATF4 的 KP-O 细胞，其肺部转移负荷出现了断崖式的下降

。相比之下，注射 KP-Y 细胞的小鼠无论是否敲除 ATF4，其本身就极低的转移负荷均没有明显变化。这表明，对于经历了衰老重塑的 KP-O 细胞而言，ATF4 是维持其转移能力的必需条件。

如果说“敲除”证明了必要性，那么“过表达”则能证明充分性。研究人员在原本缺乏转移能力的 KP-Y 细胞中过表达了 ATF4，使其表达水平达到与 KP-O 细胞相似的状态。引人注目的是，

仅仅是 ATF4 这单一因子的引入，就足以在 KP-Y 细胞中全面上调 ASNS、SLC7A11 等代谢靶点

，并同步诱导了上皮-间质转化（EMT）标志物蛋白的表达。转录组测序数据揭示，在过表达 ATF4 的 KP-Y 细胞中产生了 1661 个差异表达基因，其中有 592 个基因与 KP-O 细胞的衰老差异基因重叠。在 GSEA 通路富集分析中，过表达 ATF4 的 KP-Y 细胞展现出了与 KP-O 细胞高度一致的 UPR 和 EMT 通路富集特征。

在功能层面，过表达 ATF4 使原本安分守己的 KP-Y 细胞瞬间获得了类似于 KP-O 细胞的强大失巢凋亡抵抗力，并在体内诱导了严重的肺部转移。为了验证这一机制的普遍适应性，研究人员将这一操作延伸到了人类非小细胞肺癌细胞系 A549 中。在 A549 细胞中过表达 ATF4，不仅显著增加了肺部转移的负荷，甚至使其获得了

跨越组织屏障、在心脏等肺外器官定植的可怕能力

。至此，数据形成了一个完整的闭环：

以 ATF4 为核心的整合应激反应，既是衰老驱动肿瘤转移的必要条件，更是其充分条件。

ATF4 不仅是一个应激反应蛋白，更是细胞内代谢网络的重要转录调节枢纽。既然 ATF4 在衰老的肿瘤细胞中占据了主导地位，它必然会对肿瘤的能量代谢和物质合成途径产生深远影响。为了揭开这层代谢面纱，研究人员采用了极其精确的稳定同位素追踪技术 (Stable isotope tracing)。

首先，研究人员向培养体系中引入了 [1,2-13C]-D-葡萄糖。代谢流向数据表明，与年轻细胞相比，KP-O 细胞呈现出更高的糖酵解 (Glycolysis) 通量。这一结论的证据在于，由糖酵解途径产生的标记丙酮酸 (Pyruvate) 和乳酸 (Lactate) 在 KP-O 细胞中的丰度更高；而通过戊糖磷酸途径 (PPP) 产生的代谢物则没有明显差异。

然而，糖酵解只是葡萄糖代谢的一条通路。在肿瘤细胞中，维持三羧酸循环 (TCA cycle) 的运转对产生能量和生物合成前体至关重要。葡萄糖来源的碳可以通两条主要路径进入 TCA 循环补充中间产物（这一过程称为回补反应，Anaplerosis）：一是通过丙酮酸脱氢酶 (PDH) 途径，二是通过丙酮酸羧化酶 (PC) 途径。当研究人员使用 [3-13C]-葡萄糖进行特异性追踪时，发现 KP-O 细胞中由丙酮酸羧化酶介导的碳质掺入显著减少，这意味着

老年肿瘤细胞主动“放弃”了对葡萄糖回补途径的依赖

。

如果 TCA 循环不依赖葡萄糖进行补充，那么替代的碳源是什么？答案是氨基酸。研究人员随后进行了 [U-13C]-L-谷氨酰胺的同位素追踪。这一次的数据给出了清晰的对比：与年轻细胞相比，KP-O 细胞中由谷氨酰胺来源的 TCA 中间产物（如谷氨酸、延胡索酸、苹果酸、天冬氨酸的 M+4 同位素群）的富集比例显著上升。这种

从葡萄糖回补向谷氨酰胺回补 (Glutamine anaplerosis) 的代谢重编程

，在细胞的整体代谢率测定中也得到了印证——KP-O 细胞展现出了

显著升高的细胞外酸化率 (ECAR)

，同时耗氧率 (OCR) 保持不变，这与有氧糖酵解和谷氨酰胺回补增加的代谢特征完美契合。

更为重要的是，这种代谢模式的切换完全处于 ATF4 的掌控之下。当在 KP-O 细胞中敲除 Atf4 时，谷氨酰胺对 TCA 中间体的贡献显著锐减；反之，当在年轻的 KP-Y 细胞中人为过表达 ATF4 时，谷氨酰胺的回补通量则大幅飙升。

这种对谷氨酰胺的绝对依赖，暴露了老年肿瘤细胞在代谢灵活性上的阿喀琉斯之踵。在针对性的小分子药物筛选中，KP-O 细胞对多种代谢抑制剂（如针对 SLC7A11、BCAT 或 PHGDH 的抑制剂，甚至糖酵解抑制剂 2-DG）并未表现出特殊的脆弱性。然而，当面临谷氨酰胺匮乏，或者使用谷氨酰胺类似物 DON 时，KP-O 细胞的存活率受到了毁灭性的打击。特别是

针对谷氨酰胺酶 (Glutaminase, GLS) 的两种独立抑制剂 CB-839 和 BPTES，KP-O 细胞展现出了极其敏感的杀伤响应

。

为了追溯这种敏感性的生化根源，研究人员进行了代谢物回补实验。结果显示，只有细胞膜通透性的 α-酮戊二酸 (α-KG) 类似物 DMG、葡萄糖来源的碳源丙酮酸，以及抑制胱氨酸-谷氨酸反向转运体的 Erastin，能够挽救 KP-O 细胞对 CB-839 的敏感性。这表明，KP-O 细胞对谷氨酰胺酶抑制剂的脆弱性，根源在于其对谷氨酸（及其下游代谢产物）维持细胞存活的重度依赖。在三维培养中，使用 CB-839 处理不仅消除了 KP-O 微球体的失巢凋亡抵抗，更使得原本因过表达 ATF4 而获得生存优势的 KP-Y 细胞重新陷入凋亡的深渊。

这种体外发现的代谢漏洞，是否能在复杂的生物体内转化为真实的治疗收益？研究人员在小鼠体内开展了 CB-839 的干预试验。在静脉注射转移模型中，接受赋形剂 (Vehicle) 处理的 KP-O 组小鼠肺部布满了转移结节，而接受 CB-839（200 mg/kg）治疗的小鼠肺部，转移病灶几乎销声匿迹。更为震撼的是皮下移植模型的验证：即使经过 CB-839 的长期治疗，KP-O 皮下原发肿瘤的生长速度和最终体积依然丝毫不受影响；但与之形成鲜明对比的是，

CB-839 几乎完全切断了这些原发肿瘤向肺部发生远端转移的路径

。这一数据极其清晰地划分了转移细胞与原位细胞在代谢需求上的本质差异，证明了基于衰老和 ATF4 驱动的代谢重编程，可以作为一个专门针对“转移”这一恶性行为进行精确打击的独立治疗窗口。

为了验证 KP 模型中的发现是否适用于人类非小细胞肺癌，研究人员提取了瑞典西部地区在 2016 至 2018 年间确诊的 997 名 NSCLC 患者的临床队列数据。

在这个涵盖了各种驱动突变的大型队列中，

368 名患者携带 KRAS 突变 (KRAS-MUT)

。整个队列的

诊断中位年龄正是 71 岁

。研究人员将患者划分为年轻组（≤60 岁）和老年组（65 至 75 岁，对应实验中老年小鼠的年龄段）。流行病学统计显示，在 65 至 75 岁的患者群体中，KRAS 突变的发生率显著高于年轻组。进一步的临床分期数据显示了一个极其严峻的事实：携带 KRAS 突变的 65 至 75 岁患者，在初次诊断时处于局部晚期或远端转移（IIIb-IV 期）的比例，

显著高于同等突变背景的年轻患者

。这意味着，在人类患者中，衰老同样是驱动肿瘤恶性播散的加速器。

更令人震惊的是对原发肿瘤体积的分析。通过对有详细 CT 影像学测量记录的患者（n=464）进行数据挖掘，研究人员发现，在那些处于 IIIb-IV 期且携带 KRAS 突变的转移性肺癌患者中，

原发肿瘤的体积与诊断年龄呈现出明显的负相关

(p=0.00957)。换言之，患者年龄越大，其原发肿瘤的体积反而越小。这一真实世界的临床影像学数据，完美重现了在老年 KP 小鼠中观察到的

“原发负荷低、转移发生早”的反直觉悖论

。

那么，动物模型中的核心驱动因子 ATF4，在人类患者中是否同样具有指示意义？为了解答这个问题，研究人员首先查阅了 TCGA-LUAD（癌症基因组图谱-肺腺癌）的公共数据集。在早期（I-II 期）患者中，ATF4 的高低表达并未造成生存期的显著差异。然而，在晚期（III-IV 期）患者中，

高表达 ATF4 的群体中位生存期仅为 1.28 年

，远低于低表达群体的 2.61 年。

为了获得更加直接和精确的病理学证据，研究人员利用瑞典本地的 NSCLC 组织芯片 (TMA) 队列进行了免疫组化验证。在这批主要针对 KRAS 突变肺腺癌的切片中，数据的相关性令人瞩目：肿瘤组织中 ATF4 核内阳性细胞的百分比，与患者的诊断年龄呈现出高度显著的正相关 (p=0.0012)。65 岁以上的老年患者，其肿瘤组织内的 ATF4 染色强度远高于 60 岁以下的年轻患者。

最终的生存分析为 ATF4 的临床价值一锤定音：在这个队列中，ATF4 高表达的患者群体，其

5 年生存率仅有可怜的 32.6%

，而 ATF4 低表达组则高达 65.7%。如果将时间轴拉长至 8 年，生存率的差距进一步扩大为惊人的

13.9% 对比 60.0%

。值得注意的是，即使是在极其少数的表达了高水平 ATF4 的年轻患者中，他们的生存预后同样恶劣。这一发现极具启示意义：在肿瘤的微观世界里，以 ATF4 过度激活为标志的整合应激反应，可能构成了一个

超越人类绝对生理年龄的“肿瘤内源性衰老时钟”

。只要这个时钟被上条启动，无论宿主年龄几何，肿瘤都会展现出极度凶险的转移倾向和灾难性的临床预后。

结语

在过往的十年中，

针对谷氨酰胺代谢的抑制剂

在临床前模型中屡获奇效，却在进入人体临床试验后屡次碰壁。这项具有里程碑意义的研究为这一困境提供了一个令人信服的解释：那些临床前模型，使用的是不具备代谢依赖性、缺乏表观遗传重塑的年轻小鼠；而接受临床试验的，则是体内伴随着慢性应激和 ATF4 高度激活的平均年龄逾古稀之年的真正患者。

这项研究以前所未有的深度，确立了

衰老作为肿瘤进化主要驱动力的核心地位

。衰老并非仅仅提供让突变生根发芽的温床，它实质上是在转录、表观和代谢的底层逻辑上，为肿瘤细胞的播散铺平了道路。通过揭示衰老、整合应激反应（ISR-ATF4 轴）与谷氨酰胺依赖性代谢重编程之间的数据链路，研究不仅解释了为什么肺癌在老年人中更具侵袭性，也为针对这一最庞大、却在实验模型中被长期忽视的患者群体，

开辟了基于衰老特性的精准治疗新纪元

。

参考文献

Patel AAH, Dzanan JJ, Ali KX, Eklund EA, Alvarez SW, Raj D, Dankis M, Altinönder I, Schwarz M, Le Gal K, Bedel E, El Zowalaty AE, Jonasson E, Albatrok H, Gul N, Bossowski JP, Pillai R, Micke P, Botling J, Akyürek LM, Angeletti D, Sayin SI, Härtlova A, Papagiannakopoulos T, Olofsson Bagge R, Ståhlberg A, Hallqvist A, Wiel C, Sayin VI. Ageing promotes metastasis via activation of the integrated stress response. Nature. 2026 Mar 11. doi: 10.1038/s41586-026-10216-0. Epub ahead of print. PMID: 41813904.

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