J Clin Invest丨杨伟莉/李世华/李晓江团队利用猴模型揭示帕金森疾病新病理机制

引言

帕金森病(Parkinson’s disease,PD) 是全球第二大神经退行性疾病，在65岁以上的中老年人群中患病率约为2%， PD病人典型的病理特征是中脑黑质脑区随衰老而出现多巴胺神经细胞的渐进性退变死亡，且伴有病理性α-synuclein蛋白聚集形成的路易氏小体。绝大多数PD病人属于散发性PD，也有约10%的PD患者是由于基因突变而致病。PINK1和Parkin基因的突变可因基因功能缺失导致早发型常染色体隐性遗遗传性PD。PINK1为一种蛋白激酶，Parkin是一种E3连接酶。基于大量体外实验的传统理论认为：PINK1激酶可在Ser65位点磷酸化激活Parkin，二者共同通过线粒体自噬清除受损线粒体，保护神经细胞。虽然目前有超过3300篇PINK1、Parkin研究的相关论文，但并没有一篇报道在生理状态下的哺乳动物体内PINK1可磷酸化激活Parkin共同参与线粒体自噬的证据。而且，PINK1/Parkin敲除的小鼠及猪模型均不能模拟PD病人脑中神经细胞退变死亡的重要病理特征，限制了在动物体内对PINK1和PARKIN功能的研究可行性。

考虑到非人灵长类模型与人类更为接近，李晓江团队历经六年时间于2019年建立了世界首例PINK1基因打靶猴模型并证明了PINK1缺失在灵长类脑中可导致神经细胞死亡 （Yang et al., Cell Res 2019）。随后，该团队的杨伟莉研究员进一步发现PINK1蛋白在生理状态下的灵长类脑中特异性表达，且通过独立于线粒体自噬的其它重要激酶功能维持灵长类神经细胞存活（Yang et al., Protein Cell 2022；Chen et al., Zool Res, 2024），提示了同一致病蛋白在不同物种中的表达和功能具有种属差异。然而，PINK1的经典底物Parkin在灵长类脑中的功能如何仍不清楚，亟待探究。

2024年10月15日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院杨伟莉、李世华及李晓江团队在Journal of Clinical Investigation在线发表题为Deficiency of Parkin causes neurodegeneration and accumulation of pathological α-synuclein in monkey models的研究论文。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了不同年龄的Parkin缺失猴模型,发现Parkin缺失对猴大脑早期发育中的神经细胞存活无明显影响，但随年龄增长会造成猴中脑黑质多巴胺神经细胞的明显变性及死亡、纹状体部位多巴胺合成减少及病理性pS129-α-syn聚集（图1和图2），成功模拟了PD病人脑中的重要病理特征，这与Parkin敲除的小鼠模型及猪模型无法模拟PD病人脑中神经细胞退变死亡的重要病理形成鲜明对比，提示利用非人灵长类动物模型研究Parkin功能的重要性和必要性。

图1. （A）猴脑注射AAV病毒载体表达CRISPR/Cas9敲除Parkin基因。（B， C）免疫组化染色证明在Parkin基因打靶后猴脑黑质区多巴胺神经细胞（TH）出现明显退变死亡，且在年老（25岁）猴中的神经细胞死亡更为严重。（D）电镜结果显示，Parkin敲除可造成猴中脑黑质神经细胞的退变死亡及髓鞘退化。（E）FDOPA PET结果显示敲低猴脑黑质Parkin可显著减少纹状体部位多巴胺的水平。（Credit:Journal of Clinical Investigation）

图2. Parkin敲除可造成猴中脑黑质出现病理性pS129-α-syn聚集。（A）免疫组化染色显示Parkin敲除可在猴黑质中造成pS129-α-syn表达增加，且随着衰老这种蛋白聚集更为显著。（B）高倍镜图显示毒性α-synuclein蛋白形成路易小体。（C）对A图的聚集体进行统计。（D）在老年（25岁）猴脑黑质神经细胞的胞内及胞外均有病理性pS129-α-syn聚集体形成。（Credit:Journal of Clinical Investigation）

有研究报道Parkin Ser65突变同样可造成PD发生。大量体外研究发现PINK1可在Ser65位点磷酸化激活Parkin，但由于PINK1蛋白在生理状态下的小动物脑内及常见细胞系中因表达较低而检测不到，因此尚无生理状态下的体内证据证明PINK1介导Parkin的磷酸化。而该团队前期研究发现PINK1激酶在灵长类脑中特异性丰富表达，在本研究中进一步发现敲除PINK1基因可明显减少磷酸化Parkin(pS65-Parkin)表达并伴随出现由pS129-α-syn蛋白聚集而成的路易氏小体，该研究首次揭示了在生理状态下的动物体内PINK1可磷酸化Parkin的证据, 且Parkin 磷酸化的减少与pS129-α-syn蛋白的聚集相关。这为携带PINK1及Parkin突变的PD患者在临床上具有相似的表型提供了新的分子机制。

为了进一步验证PINK1介导的Parkin磷酸化在猴脑中的重要功能，该研究对野生型Parkin蛋白的Ser65位点进行突变（S65A）使得其不能被PINK1磷酸化。结果发现，过表达野生型PINK1和Parkin均可通过增加Parkin磷酸化水平而减少老年猴脑中病理性α-synuclein蛋白的聚集，从而发挥神经保护作用。而过表达不能被PINK1磷酸化激活的Parkin突变体 (S65A) 则不能有效清除α-synuclein蛋白的毒性作用。此外，该研究也在散发性PD患者脑组织中验证了在猴脑中的现象，发现散发性PD患者脑中磷酸化Parkin水平表达下调，且在正常衰老的猴脑中可溶性Parkin磷酸化蛋白的表达也出现明显下调，提示衰老可能是引发磷酸化Parkin功能下调从而介导脑功能异常的一个重要因素（图3）。综上，该研究利用灵长类动物模型揭示了PINK1激酶介导的Parkin蛋白磷酸化在衰老和PINK1、Parkin基因突变引发的PD中的重要保护作用，为PD的临床治疗提供了新的潜在靶点。

图3. 磷酸化Parkin在PD病理中的重要机制模型。衰老、PINK1和Parkin基因突变均可导致磷酸化Parkin的减少, 从而导致包括毒性α-synuclein蛋白的累积及神经细胞死亡（Credit:Journal of Clinical Investigation）

值得注意的是，与PINK1缺失猴模型不同，Parkin缺失对猴大脑早期发育中神经细胞功能未见明显影响，这可能是由于PINK1作为上游激酶还参与调节其它重要底物。比如，该团队还利用新鲜野生型猴脑组织进行蔗糖密度梯度离心法分离不同亚细胞器，发现PINK1和Parkin蛋白具有不同的亚细胞定位（Liu et al， Neural Regen Res 2024），也提示PINK1、Parkin蛋白除了通过Parkin磷酸化发挥功能之外，可能还有各自独立的功能。

参考文献

1. Chen XS, Han R, Liu YT, Huang W, Wang Q, Xiong X, Zhang Y, Zhao JG, Li SH, Li XJ, Yang WL. Comparative analysis of primate and pig cells reveals primate-specific PINK1 expression and phosphorylation. Zool Res. 2024 Mar 18;45(2):242-252.

2. Liu Y, Huang W, Wen J, Xiong X, Xu T, Wang Q, Chen X, Zhao X, Li S, Li X, Yang W. Differential distribution of PINK1 and Parkin in the primate brain implies distinct roles. Neural Regen Res. 2025 Apr 1;20(4):1124-1134.

3. Yang W, Liu Y, Tu Z, Xiao C, Yan S, Ma X, Guo X, Chen X, Yin P, Yang Z, Yang S, Jiang T, Li S, Qin C, Li XJ. CRISPR/Cas9-mediated PINK1 deletion leads to neurodegeneration in rhesus monkeys. Cell Res. 2019 Apr;29(4):334-336.

4. Yang W, Guo X, Tu Z, Chen X, Han R, Liu Y, Yan S, Wang Q, Wang Z, Zhao X, Zhang Y, Xiong X, Yang H, Yin P, Wan H, Chen X, Guo J, Yan XX, Liao L, Li S, Li XJ. PINK1 kinase dysfunction triggers neurodegeneration in the primate brain without impacting mitochondrial homeostasis. Protein Cell. 2022 Jan;13(1):26-46.

5. Han R, Wang Q, Xiong X, Chen XS, Tu ZC, Li B, Zhang F, Chen CY, Pan MT, Xu T, Chen LQ, Wang ZF, Liu YT, He DJ, Guo XY, He F, Wu P, Yin P, Liu YB, Yan XX, Li SH, Li X-J, Yang W. Deficiency of Parkin causes neurodegeneration and accumulation of pathological α-synuclein in monkey models. J Clin Invest. 2024.

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文章来源|“BioArt”